拓扑异构酶（英语：Topoisomerase；type I：EC 5.99.1.2，type II：EC 5.99.1.3）是一种异构酶，能使DNA长链断裂与接合。专门参与DNA拓扑构形（DNA topology）改变的过程，最早的发现者是出身台湾的生化学家王倬。DNA在结构上主要有三种拓扑构型的变化：超螺旋（supercoiling）、纽结（knotting）与连锁（catenation）。能够使DNA在不进行DNA复制与转录的时候，尽量维持其紧密性。反之在转录或复制过程中，这些拓扑构型将会阻碍反应。由于DNA一般是以双螺旋形式存在，因此较难将这些长链分开。但为了要让某些酵素能够参与转录作用或DNA复制，必须先由螺旋酶将两股DNA分离。在复制完成之后，两股环状DNA会产生拓扑学相连（形状上联成一体，但实际上没有化学键相接）的现象，或称纽结。当特定的DNA环以不同程度的扭转形式存在时，称为拓扑异构物，除非打断DNA链，否则无法经由任何方式相互转变。而拓扑异构酶就是负责催化并引导一些化学反应，以使DNA的纽结状态得以解除。此外当病毒DNA插入染色体时，或是在其他型态的重组现象中，也可能会有拓扑异构酶的参与。拓扑异构酶可依据其作用方式，而分为两种类型：第一型拓扑异构酶（Type I topoisomerase）：该类型与DNA转录及翻译有关。可将一条DNA双股螺旋完全包覆，并以破坏磷酸双酯键的方式切断其中一股DNA，使其产生一个小缺口，此时另一股完整的DNA将会穿过此缺口，之后通道重新黏合。属于这类型的有拓扑异构酶I（topoisomerase I）与拓扑异构酶III（topoisomerase III）等。第二型拓扑异构酶（Type II topoisomerase）：该类型与DNA复制有关。可将一条DNA双股螺旋上的两股DNA皆切断，产生缺口，使另一条双股螺旋能够穿过此缺口，之后再将通道重新黏合。属于这类型的有拓扑异构酶IIα与拓扑异构酶IIβ等。两种类型皆可改变DNA的环绕数。许多药物经由干扰拓扑异构酶以产生疗效。例如广效氟化奎林酮类（fluoroquinolone）抗生素能够破坏细菌第二型拓扑异构酶的机能。另外还有一些化学治疗药物能干扰癌细胞的拓扑异构酶作用，进而抑制细胞生长，或使细胞死亡：