酵母菌双杂合系统，英文为Yeast two-hybrid system，亦简称Two-hybrid screening，是一种研究蛋白质交互作用 或蛋白质和DNA交互作用的实验技术。

此系统的基本原理是报导基因上游的启动区域与转录因子结合后，使下游的报导基因表现。在酵母菌双杂合系统中将转录因子设计为结合区(Binding domain, BD)和活化区(Active domain, AD)，结合区可与基因上游的启动区域结合，活化区负责活动下游报导基因开始转录。

1989年Fields and Song率先开发出这项技术来研究蛋白质间的交互作用，他们最早使用的是Saccharomyces cerevisiae这种酵母菌的GAL4表达系统，这种利用半乳糖影响基因表现原理，来进行研究蛋白质和DNA交互作用、DNA间交互作用的筛选技术，在大肠杆菌中有更多的应用。