4Pi显微镜是改进轴向分辨率的激光扫描萤光显微镜 。分辨率由原本的500至700 奈米提高到100-150 奈米，几乎相当于降低5至7倍焦显微镜的球状焦点体积。

透过同时将两个反向的物镜聚焦在同一个位置上可以提轴向的分辨率。且调整通过物镜的两道光的光程差，使其最小。透过这个方法，在两物镜共同聚焦处的分子可以被相干地照亮，且可以收到相干地反射光或是穿透光，例如：侦测器可以接收到发射光地相干叠加。用于照明与侦测的体角 ${\displaystyle \mathrm{\Omega <!--\; \Omega \; -->}}$也增加并接近理想状态(样品同时照射和检测到来自各方向的光)。

在图中显示4Pi显微镜的操作模式。 激光由一分光镜 (BS)分光并透过镜子打在两个相反的物镜。在共同焦点处，两道聚焦光束会叠加。 激发的分子在这个位置发出荧光，且被两个物镜收集，由同一分光镜收集，最后被分色镜 (DM)偏折至接收器。

在理想情况下，每个物镜可以收集立体角 ${\displaystyle \mathrm{\Omega <!--\; \Omega \; -->}=2\mathrm{\pi <!--\; \pi \; -->}}$的光线。 因此，有两个物镜可以收集所有方向方向的光(立体角 ${\displaystyle \mathrm{\Omega <!--\; \Omega \; -->}=4\mathrm{\pi <!--\; \pi \; -->}}$)。 名此显微镜也是得名于其最大可激发和侦测光的角度。实际上，物镜最多只可达到约140°的孔径角，其对应 ${\displaystyle \mathrm{\Omega <!--\; \Omega \; -->}\approx <!--\; \approx \; -->1.3\mathrm{\pi <!--\; \pi \; -->}}$。