在分子生物学中蛋白酶K（英语：Proteinase K，EC 3.4.21.64，也被称为内肽酶K（endopeptidase K）、腐生真菌碱性蛋白酶（Tritirachium alkaline proteinase）、腐生真菌丝氨酸蛋白酶（Tritirachium album serine proteinase）、腐生真菌蛋白酶K（Tritirachium album proteinase K），是一种用途广泛的丝氨酸蛋白酶。这种酶于1974年在真菌 白色侧齿霉菌（英语：Engyodontium album）（）的提取物中发现。蛋白酶K能消化天然的角蛋白（Kerati），而得名蛋白酶K。其主要的切割位点是脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。由于其广泛地的切割能力，在实验室中很常用。此蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶SB超家族中的S8家族（枯草杆菌蛋白酶也属于这个超家族）。蛋白酶K的分子量为28.9千道尔顿。

酵素偏好的切位是在疏水性氨基酸后的位置。本酵素由钙活化，虽然钙并不会影响酵素的活性，但它可使酵素更稳定。

在足量酵素浓度及作用时间的环境下，蛋白质会完全被水解。若移除钙离子，蛋白酶K的稳定性会大幅降低，但其水解活性仍然存在。蛋白酶K对于钙离子具有两个结合位，都在活性中心附近，但都与催化反应无直接关联。在常用缓冲液中的蛋白酶K活性

蛋白酶K时常应用于分子生物学领域。在制备核酸时，蛋白酶K可以将杂蛋白去除，并迅速使核酸酶失活，避免其降解目标产物DNA和RNA。另外，蛋白酶K还有其他优点，它在变性剂存在下仍能保有活性，如SDS、尿素、EDTA等等，这点与其他蛋白酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）相当不同。