DNA连接酶（EC 6.5.1.1），也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是把两条DNA黏合成一条。无论是双股或是单股DNA的黏合，DNA连接酶都可以借由形成磷酸双脂键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端连在一起。虽然在细胞内也有其他的蛋白质，例如像是DNA聚合酶在其中一股DNA为模板的情况下，将另一边的DNA单股断裂端，透过聚合反应的过程形成磷酸双脂键来黏合DNA。但是DNA聚合酶的黏合过程却只是聚合反应一个附带的功能而已，真正在细胞内扮演DNA黏合反应的工作还是以DNA连接酶为主。

顾名思义，DNA连接酶的功能便是在黏合断裂的DNA，而细胞内只有DNA复制与DNA修复的反应牵涉到DNA断裂的合成，因此DNA连接酶就是在上述的两个机制扮演重要的角色。除了细胞内的黏合反应，随着分子生物学的进展，几乎大多数的分子生物实验室都会利用DNA连接酶来进行重组DNA的实验，或许这也可以被规类为其另一着重要的功能。

关于DNA连接酶的化学反应过程，首先是一条DNA的3'端要先修饰成羟基（OH-），而另一条的5'端则是必须带有磷酸，借由DNA连接酶的作用促进磷酸双脂键的共价键，同时核苷酸序列以嘌呤—嘧啶两两对应的方式完成配对，这样才算完成反应。

用下面这张图解来说明或许可以更清楚的说明反应过程：以黏性末端为例

反应后

DNA连接酶也可以处理钝端，即就算没有嘌呤—嘧啶配对的碱基对，也是可以进行上述的反应。

在哺乳类细胞，至少有四种黏合酶被发现与命名：

前面提到，随着分子生物学的进展，DNA黏合酶对于研究人员的贡献也越来越显得重要，尤其是在进行重组DNA实验时更是不可或缺。比如说，科学家需要表现某个抗药基因，首先就事先利用限制酶将这一段基因的两端修饰成可黏合的末端，另外透过同样的限制酶将准备用来承接表现一段基因的质体修饰成可与该段基因进行黏合的两端，这时候透过T4噬菌体所携带的DNA连接酶（T4 DNA ligase）将抗药基因与质体黏合在一起，这整个操作的过程就称作DNA重组，而在这里所使用的T4噬菌体DNA连接酶则是最广为使用的DNA连接酶。