糖酵解（英语：glycolysis，又称糖解）是把葡萄糖（C6H12O6）转化成丙酮酸（CH3COCOO− + H+）的代谢途径。在这个过程中所释放的自由能被用于形成高能量化合物ATP和NADH。
糖酵解作用是所有生物细胞糖代谢过程的第一步。糖酵解作用是一共有10个步骤酶促反应的确定序列。在该过程中，一分子葡萄糖会经过十步酶促反应转变成两分子丙酮酸（严格来说，应该是丙酮酸盐，即是丙酮酸的阴离子形式）。
糖酵解作用及其各种变化形式发生在几乎所有的生物中，无论是有氧和厌氧。糖酵解的广泛发生显示它是最古老的已知的代谢途径之一。事实上，构成糖酵解作用及其并行途径的戊糖磷酸途径，在金属的催化下发生在还不存在酶的太古宙海洋。糖酵解作用可能因此源于生命出现之前世界的化学约束。
糖酵解作用发生在大多数生物体中的细胞的胞质溶胶。最常见的和研究最彻底的糖酵解作用形式是双磷酸己糖降解途径（Embden-Meyerhof-Parnas途径，简称：EMP途径），这是被Gustav Embden，奥托·迈尔霍夫，和Jakub Karol Parnas所发现的。糖酵解作用也指的其他途径，例如，脱氧酮糖酸途径（Entner-Doudoroff途径（英语：Entner–Doudoroff pathway））各种异型的和同型的发酵途径，糖酵解作用一词可以用来概括所有这些途径。但是，在此处的讨论却是局限于双磷酸己糖降解途径（EMP途径）。
整个糖酵解作用途径可以分成两个阶段：
糖酵解作用的总体反应式：
对于简单发酵，一个葡萄糖分子到两个丙酮酸分子的代谢具有净产率2个ATP分子。然后，大部分细胞将进行进一步的反应，以“偿还”用过的NAD+.，并产生最终产物乙醇或乳酸。许多细菌使用无机化合物作为氢的受体来再生NAD+。
细胞进行有氧呼吸合成更多的ATP，但不作为糖酵解作用的一部分。这些进一步的有氧反应使用来自糖酵解作用的丙酮酸和NADH + H+。真核生物有氧呼吸从每个葡萄糖分子产生额外的约34个ATP分子，但是其中大部分是由截然不同的机制，以在糖酵解的底物水平磷酸化产生的。
糖酵解作用在细胞的细胞质中进行。早先人们只知道糖在无氧环境下可降解为乳酸，但今天人们终于清楚知道，不论有氧还是无氧环境，糖会经过同样的过程分解为丙酮酸。不同的则是在有氧条件下，丙酮酸被移出一分子的二氧化碳，剩余的二碳以不稳定的键结连接至辅酶A（一种衍生自维生素B5的含硫化合物），形成具有异常活泼乙酰基（附着的乙酸盐）的化学修饰物乙酰辅酶A，从而进入三羧酸循环。
在原核生物和真核生物的大部分缺氧细胞或组织（骨骼肌）中，丙酮酸会转化成乳酸，或者像糖类被酵母分解那样，转化为乙醇和二氧化碳（CO2）。在有氧环境下工作的组织（典型：心肌细胞）分解三碳的丙酮酸为乙酰辅酶A和二氧化碳，乙酰辅酶A会进一步行三羧酸循环分解为CO2和氢。氢会与氢载体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合成（NADH和FADH2）。在线粒体里进行的呼吸链，NADH和FADH的氧化会导致ATP的产生，能量会储存在ATP的高能磷酸键供细胞使用。
糖酵解作用是唯一一条现代生物都具有的代谢途径，出现时间很早。糖酵解作用最早可能发生在35亿年前第一个原核生物中。
糖酵解的第一步是葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖。不同细胞类型中所含有的酶也不一样，在所有的细胞中，皆有己糖激酶进行催化，而在肝和胰腺中，则另外含有一种称为葡（萄）糖激酶（己糖激酶IV）的酵素。磷酸化过程消耗一分子ATP，后面的过程证明，这是回报很丰厚的投资。细胞膜对葡萄糖通透，但对磷酸化产物6-磷酸葡萄糖不通透，后者在细胞内积聚并继续反应，将反应平衡向有利于葡萄糖吸收的那一面推移。之后6-磷酸葡萄糖会在磷酸己糖异构酶的催化下生成6-磷酸果糖。（在此果糖也可通过磷酸化进入糖酵解作用途径）
接着6-磷酸果糖会在磷酸果糖激酶的作用下被一分子ATP磷酸化生成1,6-二磷酸果糖，ATP则变为ADP。这里的能量消耗是值得的，：首先此步反应使得糖酵解作用不可逆地继续进行下去，另外，两个磷酸基团可以进一步在醛缩酶的参与下分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。磷酸二羟丙酮会在磷酸丙糖异构酶帮助下转化为3-磷酸甘油醛。两分子3-磷酸甘油醛会被NAD+和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的氧化下生成1,3-二磷酸甘油酸。
下一步反应，1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸。此反应由磷酸甘油酸激酶催化，高能磷酸键由1,3-二磷酸甘油酸转移到ADP上，生成两分子ATP。在此，糖酵解作用能量盈亏平衡。两分子ATP消耗了又重新生成。ATP的合成需要ADP作原料。如果细胞内ATP多（ADP则会少），反应会在此步暂停，直到有足够的ADP。这种反馈调节很重要，因为ATP就是不被使用，也会很快分解。反馈调节避免生产过量的ATP，节省了能量。磷酸甘油酸变位酶推动3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸，最终成为磷酸烯醇式丙酮酸。磷酸烯醇式丙酮酸是高能化合物。最后，在丙酮酸激酶的作用下磷酸烯醇式丙酮酸生成二分子ATP和丙酮酸。此步反应也受ADP调节。
糖酵解作用反应序列可被分为十个步骤
医学导航：遗传代谢缺陷
代谢、k,c/g/r/p/y/i,f/h/s/l/o/e,a/u,n,m
k,cgrp/y/i,f/h/s/l/o/e,au,n,m,人名体征
药物(A16/C10)、中间产物(k,c/g/r/p/y/i,f/h/s/o/e,a/u,n,m)
通常视前五步为准备（或投入）阶段，因为这些步骤消耗能量以将葡萄糖转变为两个丙糖磷酸，即甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮。
此步骤中的酵素，与己糖分子结合，本身的构形会发生改变，催化葡萄糖磷酸化，既然被命名为己糖激酶，代表其不仅仅催化右旋-葡萄糖，而也具备催化其他六碳的糖类，像是右旋-果糖以及右旋-甘露糖磷酸化的功能，而这种酶，以不同的同工酶存在于不同的生物体或组织中，在肌肉中，是一种调节性酶，当葡萄糖-6-磷酸和腺苷二磷酸的浓度超出正常值，便可以暂时的抑制己糖激酶，使之形成与利用的反应达到速率平衡。
而肝脏中，存在于一种特殊的己糖激酶名叫葡萄糖激酶，这种酶只对葡萄糖有专一性，并不会与所有己糖发生作用，而且此酶并不受葡萄糖-6-磷酸的抑制作用。它对葡萄糖的米氏常数为5～10毫摩尔/升，比己糖激酶的0.1毫摩尔/升要高很多，根据米氏常数的意义，当葡萄糖浓度很高时它才作用。由于肝脏是糖原的重要生成器官，因此当血糖浓度增高时，肝脏中的葡萄糖激酶就运作，生成了葡萄糖-6-磷酸，肝脏以此合成肝糖原。然而，此酶的合成受到胰岛素的诱导，因此，体内缺乏胰岛素的糖尿病患者的肝脏中此酶的合成速率低，影响肝脏中葡萄糖转变为葡萄糖-6-磷酸的速率，故分解葡萄糖以及合成肝糖原的过程受阻。
辅因子：镁离子
此反应的标准自由能变化 Δ G ∘ ′ = + 0.4 {\displaystyle \Delta G^{\circ '}=+0.4} 千卡/摩尔，由于自由能变化小，因此反应可往二侧进行，而此异构酶亦须镁离子，且对葡萄糖-6-磷酸及果糖-6-磷酸有专一性，由于产物F6P不断被下一阶段所消耗，造成F6P的浓度很低，反应往回进行的速率较低，若果糖-6-磷酸的浓度很高，反应将遵守勒沙特列原理，产生出葡萄糖-6-磷酸。
此反应的标准自由能变化 Δ G ∘ ′ = − 3.40 {\displaystyle \Delta G^{\circ '}=-3.40} 千卡/摩尔，故为不可逆反应。此反应为糖酵解作用中，第二个重要的控制点，在细胞内磷酸果糖激酶反应为不可逆的。而磷酸果糖激酶，与果糖激酶一样，属于一种调节性酶，且为肌肉糖酵解作用中主要的调节性酶，受到ATP与AMP数量比的影响：当ATP过多时，ATP结合到酶的调控部位，酶的构象发生变化而受抑制；AMP会解除此酶的抑制，使其恢复高效状态。氢离子浓度对此酶也有抑制作用：当血液中的乳酸较多时，即氢离子浓度增高，这样就抑制了酶，使得糖酵解效率下降，阻断了糖酵解下游生成乳酸的途径，因此这种调控有着重要的生理意义。
辅因子：Mg2+
糖酵解作用的第二阶段为放能阶段，此阶段的目的在于产生高能分子ATP和NADH。因为一个葡萄糖在准备阶段时已经变成两个丙糖，所以在放能阶段中每个反应会发生两次。最后产生2个NADH和4个ATP，使得单一葡萄糖在经过整个糖酵解作用后净得2个NADH和2个ATP。ATP会用于其他需能反应，而NADH则会进入呼吸链或作为还原剂参与细胞内其他还原加氢反应。
被脱下的氢用于还原氢载体NAD+，形成NADH。
辅基： 两个Mg2+:
辅基： Mg2+
人体可通过糖异生，即从非糖化合物，如丙酮酸和乳酸等物质重新合成葡萄糖。当肝或肾以丙酮酸为原料进行糖异生时，糖异生中的其中七步反应是糖酵解中的逆反应，它们有相同的酶催化。但是糖酵解中有三步反应，是不可逆反应。在糖异生时必须绕过这三步反应，代价是更多的能量消耗。
这三步反应都是强放能反应，它们分别是：
1葡萄糖经已糖激酶催化生成6磷酸葡萄糖ΔG= -33.5 kJ/mol
2 6磷酸果糖经磷酸果糖激酶催化生成1，6二磷酸果糖ΔG= -22.2 kJ/mol
3磷酸烯醇式丙酮酸经丙酮酸激酶生成丙酮酸ΔG= -16.7 kJ/mol
糖酵解作用在体内可被精确调节，这样一方面可以满足机体对能量的需要，另一方面又不会造成浪费。同时，当细胞内还进行糖异生的时候，调节就显得非常重要了，因为要避免空循环的发生。
调节是通过改变底物浓度，酶的活性实现的。
磷酸果糖激酶是其中最重要的限速酶，这也是巴斯德效应的关键参与者，它也决定了糖异生的速度，成为调节位点。AMP的浓度越高，酶的活性越高。就是当机体大量消耗了ATP，而相应又产生了很多AMP的时候，酶的活性提高，使得糖酵解按生成ATP的方向快速前进，以提高ATP产量。
在细胞中，NADH与NAD+是处于动态平衡的。在糖酵解过程中生成的NADH必须被进一步氧化，转化为NAD+才能够让糖酵解持续进行。另外足够的NAD+是3磷酸甘油醛成为1，3二磷酸甘油酸这一步反应重要的前提。在此过程中NAD+会被还原为NADH+H+，即是氢载体，通过穿梭将氢带到呼吸链。
NAD+的再生可通过这三种不同的过程来实现。
值得一提的是，生成1，6-二磷酸果糖后的大部分反应都是向能量升高的方向进行的，没有酶（磷酸果糖激酶（PFK），磷酸甘油酸激酶（PGK））的催化，是不会自发进行的。而糖酵解的逆过程--糖异生（从甘油等非糖物质生成葡萄糖）则容易进行，此过程用到大部分在糖酵解里面出现过的酶，除了提到的两位“车夫”外，它们只出现在糖酵解中。在糖异生这两步逆反应会放出大量的热，分别为-14及-24 kJ/mol。
在糖酵解作用中，每分子葡萄糖提供两分子ATP。真核生物的粒线体能同时从两分子丙酮酸中另外获得36分子ATP。能量转化的多少取决于在细胞质中产生的NADH + H+通过粒线体膜的方式。
不论在无氧还是有氧环境中，糖酵解成丙酮酸这一过程都能进行。3-磷酸甘油醛在3－磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH的作用下脱氢。脱下的氢离子会将氧化剂（辅酶）NAD+还原成NADH + H+。NAD+会在呼吸链中再生。若在无氧环境，放热的（ΔGo´ = - 25 kJ/mol）乳糖脱氢酶（LDH）反应会再生NAD+：丙酮酸的还原会生成乳糖和再生NAD+（酵母则会使用另外两种酶—丙酮酸脱羧酶加乙醇脱氢酶）。下图可阐明此过程：
无氧环境下糖酵解作用GAPDH-和LDH-反应的相互联系，除了少部分NADH+H+会被磷酸甘油脱氢酶（GDH）转化外，大部分会用于再生NAD+。
醛缩酶（A、B（英语：Aldolase B）、C（英语：Aldolase C）） · 磷酸丙糖异构酶
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k,cgrp/y/i,f/h/s/l/o/e,au,n,m,人名体征
药物(A16/C10)、中间产物(k,c/g/r/p/y/i,f/h/s/o/e,a/u,n,m)